«ПЕРВЫЙ СРЕДИ РАВНЫХ...»
Нормативные документы
Противодействие коррупции
Поступающим
Студентам
Выпускникам
Проект 5-100
Аккредитация специалистов
Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток 26.02.2010

Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток

Более двух десятилетий исследователи и клиницисты пытаются разработать метод лечения, который гарантировал бы эффективное восстановление кожных покровов пациентам, получившим тяжелые ожоговые и травматические повреждения либо страдающим трофическими язвами различной этиологии. На сегодняшний день наиболее эффективной является операция аутотрансплантации кожи. В перспективе, на смену ей может придти аутотрансплантация выделенных из биоптатов неповрежденных участков кожи и размноженных в культурах in vitro клеток-предшественниц кератиноцитов на трехмерных матриксах [1]. Главным недостатком этого подхода остается то, что на экспансию кератиноцитов в культурах in vitro перед трансплантацией требуется около 3 недель [2]. В течение всего этого времени пациент подвергается риску инфицирования и обезвоживания открытой ожоговой раны. Недели перед проведением аутотрансплантации остаются тем критическим периодом, в котором необходимо обеспечить максимальную защиту поврежденных покровов. В качестве временного покрова возможно использование децеллюляризованного трупного кожного лоскута, однако доступность подобного материала ограниченна, а его применение нередко приводит к развитию реакций воспаления.

Чтобы избежать применения временных трансплантатов и операций аутотрансплантации, предпринимается множество попыток разработки «эквивалентов кожи» на основе инертных синтетических и тканеинженерных матриксов, обычно содержащих коллаген I типа и аллогенные клетки (дермальные фибробласты и реже – фибробласты и кератиноциты) [3]. Однако до настоящего времени ни один из этих продуктов не продемонстрировал высокой эффективности в лечении пациентов с обширными глубокими ожогами [4].

Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека могло бы стать решением проблемы создания эквивалентов кожи, пригодных для трансплантации, позволив получать необходимые типы клеток (дермальные фибробласты и кератиноциты) в неограниченном количестве. Основным препятствием использования данного подхода остается недостаточная эффективность протоколов дифференцировки ЭСК в требующиеся типы клеток и потенциальная туморогенность ЭСК [5-7]. Единственная оставшаяся в предназначенной для клинического использования клеточной культуре недифференцированная эмбриональная стволовая клетка теоретически может привести к формированию у реципиента тератомы – опухоли, развивающейся из ЭСК при их трансплантации.

В 2003 г. были впервые получены фрагменты кожи на основе кератиноцитов, дифференцированных из ЭСК мыши [8]. С тех пор предпринималось множество попыток разработки протокола дифференцировки ЭСК человека в кератиноциты, однако полученные клетки по неясным причинам не были способны к активной пролиферации [9]. Основная задача этих исследований – создание функционального стратифицированного эпидермиса с базальным слоем, содержащим малодифференцированные клетки-предшественницы кератиноцитов, – до настоящего времени так и не была решена [9-11].

В журнале The Lancet были опубликованы результаты работы научной группы, возглавляемой профессором C. Baldeschi. Исследователям впервые удалось получить эквиваленты кожи, аналогичные по своей структуре нормальной коже человека. В своей работе ученые создали протокол дифференцировки, моделирующий длительный многоступенчатый процесс дифференцировки клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в базальные кератиноциты эмбриона. Ключевым звеном этого протокола оказалось время, в течение которого клетки культивировали в среде, содержащей индукторы дифференцировки. Интересно отметить, что до этого ученые многие годы не обращали внимания на временные параметры, сосредоточившись на разнообразных химических индукторах дифференцировки [9-12].

ЭСК человека линий Н9 и SA01 культивировали на фидерном слое инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в течение 40 суток в питательной среде, содержащей 0,5 ммоль/л BMP4 (bone morphogenetic protein 4) и 0,3 ммоль/л аскорбиновой кислоты. В течение первых 20 суток культивирования в клетках постепенно снижалась экспрессия эмбриональных маркеров Oct4 и Nanog, а к 40 суткам прекращалась экспрессия маркера SSEA3, что было подтверждено количественным ПЦР-анализом, флуоресцентно-активированным клеточным сортингом (FACS) и методом иммуноцитохимии. Параллельно с утратой эмбриональных маркеров в ЭСК происходила последовательность молекулярных событий, аналогичная происходящей в клетках развивающихся эмбриональных покровов [13-15]. В течение первых 10 суток нарастала продукция кератинов 8 и 18, после чего она начинала снижаться, сменяясь продукцией кератинов 5, 14 и 18. К 40 суткам в клетках активно продуцировались кератины 5 и 14, а экспрессия кератина 18 прекращалась. В контрольных культурах нормальных базальных кератиноцитов человека наблюдался аналогичный паттерн экспрессии кератинов, более того, в базальных кератиноцитах и кератиноцитах, полученных из ЭСК (К-ЭСК), совпадала и внутриклеточная локализация данных маркеров. Единственное отличие двух типов клеток заключалось в том, что в К-ЭСК не было отмечены экспрессии антигенов HLA-ABC и HLA-DR.

Эффективность дифференцировки в базальные кератиноциты была одинаковой для обеих использованных линий ЭСК и составляла около 95%. После селекции клетки были высеяны на фибриновый матрикс, заселенный дермальными фибробластами человека. После того, как монослой К-ЭСК на поверхности матрикса достигал конфлюэнтности, полученные «кожные» лоскуты трансплантировали мышам с иммунодефицитом (nu/nu, n=5). Через 10-12 недель после трансплантации образцы ткани фиксировали и оценивали иммуногистохимическим методом на присутствие специфических маркеров дифференцировки кератиноцитов. Следует отметить, что ни у одного из животных не было выявлено развития опухолей. 

Схематическая презентация протокола дифференцировки чЭСК в кератиноциты

Схематическая презентация протокола дифференцировки чЭСК в кератиноциты
 

К-чЭСК – кератиноциты, полученные из чЭСК.

Было показано, что К-ЭСК формируют нормальный стратифицированный эпителий. В базальном слое наблюдали экспрессию кератинов 5 и 14, интегринов α6 и β4, коллагена VII типа и ламинина 5. В слоях, лежащих над базальным, обнаруживался кератин 10, а инволюкрин и филаггрин – маркеры терминальной дифференцировки кератиноцитов, – продуцировались только в верхних слоях эпидермиса. Структура и плотность образовавшихся покровов также повторяла структуру и плотность нормальной кожи человека. При этом в базальном слое происходила пролиферация клеток, что было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер Ki-67. Таким образом, полученная искусственная кожа была способна к обновлению.

Авторы этой работы уверены, что полученные ими эквиваленты кожи в будущем могут успешно применяться в качестве временных покровов, защищающих открытые раны перед предстоящей аутотрансплантацией. Возможно, они также смогут стать полноценной заменой аутотрансплантатов. Самоподдерживающиеся линии ЭСК решат проблему доступности материала, а низкая экспрессия молекул HLA на мембране полученных К-ЭСК должна свести к минимуму вероятность развития иммунных реакций при использовании трансплантата.

Выполненных на сегодняшний день экспериментов недостаточно для внедрения полученного продукта в клиническую практику. Для подтверждения безопасности использования искусственной кожи на основе К-ЭСК необходимо проведение расширенных доклинических испытаний на большем количестве экспериментальных животных, доказательство геномной стабильности и всесторонняя характеристика К-ЭСК. Тем не менее, данная работа – первое доказательство возможности получения чистых культур базальных кератиноцитов из ЭСК человека. Более того, это исследование является первым принципиально новым шагом в разработке разнообразных тканеинженерных эквивалентов кожи человека, история которых насчитывает уже более 20 лет [16].

По материалам:Guenou H., Nissan X., Larcher F. et al. Human embryonic stem-cell derivatives for full reconstruction of the pluristratified epidermis: a preclinical study. The Lancet 2009; 374: 1745-53.

Библиография:

1. Augustin M., Ermut T., Johnsen S. Effects of autologous keratinocyte transplantation the quality of life of patients with severe chronic leg ulcers. Dermatol. Psychosomat. 2001; 2: 73-6. [Abstract]

2. Gallico G.G., O’Connor N.E., Compton C.C. et al. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 448–51. [Abstract]

3. Metcalfe A.D., Ferguson M.W. Bioengineering skin using mechanisms of regeneration and repair. Biomaterials 2007; 28: 5100–13. [Abstract]

4. Alsbjorn B. In search of an ideal skin substitute. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. 1984; 18: 127–33. [Abstract]

5. Bongso A., Fong C-Y., Gauthaman K. Taking stem cells to the clinic: major challenges. J. Cell. Biochem. 2008; 105: 1352-60. [Abstract]

6. Knoepfler P.S. Deconstructing stem cell tumorigenicity: a roadmap to safe regenerative medicine. Stem Cells 2009; 27: 1050-6. [Abstract]

7. Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells 2001; 19: 193–204. [Full Text]

8. Coraux C., Hilmi C., Rouleau M. et al. Reconstituted skin from murine embryonic stem cells. Curr. Biol. 2003; 13: 849–53. [Abstract]

9. Iuchi S., Dabelsteen S., Easley K. et al. Immortalized keratinocyte lines derived from human embryonic stem cells. PNAS 2006; 103: 1792–97. [Full Text]

10. Green H., Easley K., Iuchi S. Marker succession during the development of keratinocytes from cultured human embryonic stem cells. PNAS 2003; 100: 15625–30. [Full Text]

11. Aberdam D. Epidermal stem cell fate: what can we learn from embryonic stem cells? Cell Tissue Res. 2008; 331: 103–37. [Abstract]

12. Metallo C.M., Ji L., de Pablo J.J., Palecek S.P. Retinoic acid and bone morphogenetic protein signaling synergize to efficiently direct epithelial differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 2008; 26: 372–80. [Full Text]

13. Byrne C., Tainsky M., Fuchs E. Programming gene expression in developing epidermis. Development 1994; 120: 2369–83. [Abstract]

14. Fuchs E. Epidermal differentiation and keratin gene expression. J. Cell. Sci. Suppl. 1993; 17: 197–208. [Abstract]

15. Turksen K., Troy T.C. Epidermal cell lineage. Biochem. Cell. Biol. 1998; 76: 889–98.

16. Bell E., Sher S., Hull B. et al. The reconstitution of living skin. J. Invest. Dermatol. 1983; 81: 2s-10s. [Full Text]


Исходная статья: Клеточная трансплантология и тканевая инженерия
Авторы:  А.С. Григорян